微核试验

何谓微核试验
与微核试验一起实施的典型遗传毒性试验
基于荧光显微成像系统的微核观察

何谓微核试验

下面对食品或医药品等的安全性验证方法之一的遗传毒性试验以及其中具有代表性的微核试验的概要与原理进行说明。

何谓遗传毒性和遗传毒性试验

首先对遗传毒性的判别以及其性质进行说明。
遗传毒性是指，化学物质或放射线等作用于细胞内的染色体，通过改变结构等方式，改变其特性。即使某化学物质具有遗传毒性，该物质单体无法表现出毒性。只有当遗传毒性作用于体细胞时，才会引起癌症等疾病甚至引起可遗传后代的遗传病。此外，给DNA造成不可逆的遗传变化（基因突变）的特性称为“诱变”。广义上遗传毒性也包含诱发不遗传至后代的DNA或染色体变化的特性。

“遗传毒性试验”是指，对用于医药品、食品添加剂、农药、一般化学品等的化学物质是否含有上述潜在毒性进行评价的试验。一般在哺乳类动物或哺乳类采取的细胞投入试验物质，并调查其相互作用所产生的DNA损伤或染色体异常等进行评价。制定医药品管制相关指南的国际会议“ICH（人用药品注册技术要求国际协调会议）”设定了医药品的遗传毒性试验相关的国际指南。各种遗传毒性试验的实施方法及试验结果评价等通常遵照ICH指南。该指南由参加ICH的各个国家及地区的管制当局交换意见并经过专家工作组会议讨论后实施修订。

何谓微核试验

微核试验是一种遗传毒性试验，其通过调查投入了试验物质（化学物质等）的细胞内是否出现微核及其出现率，评价物质是否具有导致染色体异常的遗传毒性的试验。微核是指，由于化学物质等作用，在细胞分裂时发生染色体分裂异常，未被注入主核的染色体片断被留下而产生的小型核。
根据投入试验物质的对象形态，微核试验分为以下2种。

in vivo微核试验：使用哺乳动物（中国仓鼠或小鼠等“啮齿”动物）的微核试验。
in vitro微核试验：使用哺乳类（CHL/IU细胞：中国仓鼠衍生的肺细胞等）培养细胞的微核试验。

微核试验中产生微核的原理

下图表示在微核试验中试验物质具有遗传毒性时，在细胞内产生微核的原理。

(1)分裂中期：投入哺乳动物或哺乳类培养细胞的试验物质具有变异原性时，发生染色体断裂等的染色体异常。
(2)分裂后期：断裂的染色体片段留在细胞内继续分裂。
(3)分裂末期：未注入主核的染色体片段与主核分离而单独作为微核留在子细胞内。
* 微核试验还有在分裂末期使用阻止分裂为子细胞的细胞松弛素B的方法。此时，分裂末期的细胞内会产生各2个主核与微核。

利用显微镜检测分裂末期产生的微核，评价染色体异常的遗传毒性。利用显微镜观察时一般使用荧光染色或吉姆萨染色等。微核尺寸约为1 μm，因此在使用显微镜进行高倍率观察时，从多个分裂细胞中难以找到微核，要求测量人员具备高超的观察技术。

与微核试验一起实施的典型遗传毒性试验

下面介绍除了通过投入试验物质来调查染色体异常的微核试验以外，评价DNA损伤性或染色体异常诱发性等遗传毒性的典型遗传毒性试验。此外，为了进行更准确的评价，有时将试验方法与检测内容不同的遗传毒性试验与微核试验组合实施。

彗星实验

彗星实验是指，调查1个细胞（单细胞）来检测DNA初始损伤的in vivo试验，也称为彗星试验或单细胞凝胶电泳试验。本实验是将单细胞标本在碱性条件下进行电泳。此时，用作标本的单细胞核产生DNA损伤时，DNA断片的移动痕迹形成彗星状图像。而未受损伤的DNA部分保持球形。与in vivo微核试验的重要区别在于，由于使用单一细胞，可用于评估不会发生分裂的脏器细胞的DNA损伤。常用于评估各类脏器或组织上非增殖细胞。对检测低浓度的遗传毒性致癌物质具有高灵敏性，对非致癌物质显示高特异性。

使用同一动物进行的彗星实验与微核试验的组合试验，是可减少用于试验的动物数量与试验时间的合理的试验方法。

染色体畸变实验

染色体畸变实验是指，在增殖期的CHL/IU细胞等哺乳类培养细胞或人淋巴细胞染色体标本投入试验物质，以调查染色体异常的in vitro试验。不同于调查分裂末期微核产生的微核试验，染色体畸变实验使用分裂中期的染色体标本调查染色体异常的有无。通过此试验检测的染色体异常包括，产生于一个染色单体中的断裂或在2处以上断裂部位发生的互换等“结构畸变”，以及出现染色体数量增减的异倍性或多倍性导致的染色体数量倍增的“数量畸变”。

在调查分裂中期染色体异常的染色体畸变实验中诱变作用不明确时，作为2次筛查试验，还可实施调查分裂末期的微核试验。

Ames试验（回复突变试验）

Ames试验（艾姆斯试验）是指，为检测遗传毒性致癌物质而进行的试验，也称为回复突变试验。在无法自己产生氨基酸的突变菌株投入试验物质时，由于诱变剂作用，形成可自己产生氨基酸的回复变株菌落，据此检测诱发突变性。在将老鼠伤寒菌或大肠杆菌用作菌株的in vitro试验中，用不含氨基酸的软琼脂培养基培养后测量菌落，根据菌落所占比重判定阴性或阳性。

专用于遗传毒性致癌物质的试验中，检测基因突变的Ames试验结果若为阳性，还可将in vivo微核试验作为2次筛查试验来组合实施。

基于荧光显微成像系统的微核观察

观察微核试验的微核时，一般使用显微镜进行目视观察或手动计数、测量。但为了获得统计学上有效的数据，必须以高倍率观察大视野范围内的大量细胞。在较大的视野范围下，从数量庞大的分裂中的细胞里找出1μm的微核并手动计数，对测量人员要求高超技术的同时，花费巨大的劳力。此外，要获得试验结果需要花费大量时间。

利用荧光显微成像系统解决微核观察的课题

一体化荧光显微成像系统BZ-X800，可解决包括微核试验在内的各种遗传毒性试验中使用显微镜观察时的诸多问题。通过自动拍摄高倍率拼接图像的图像拼接功能，可轻松获得兼具高分辨率与大视野的图像。在导航图上找到微核位置后，只需一键即可快速移动到相应位置并放大观察。实现微核的快速确认。
通过混合细胞计数的掩模测量功能和指定检出对象的尺寸，可轻松提取微核并进行数值化，在减轻测量人员的作业负担的同时大幅缩短获取试验结果的时间。
BZ-X800搭载的高灵敏度黑白制冷CCD不仅适合高精细荧光观察，还可简单快速地切换至适合明视场观察的彩色观察模式。因此，仅需一台就可支持微核试验或彗星实验等遗传毒性试验，以及需要使用显微镜的各种试验。外形小巧可以合理的安排在实验室需要放置的位置，而且内置暗室，在明亮的环境下也可以使用。